Review Paper 13
古川 良明*
「銅シャペロンタンパク質CCSによる細胞内銅動態の制御メカニズム」
生体の科学 2024 Vol. 75, pp. 122-126
京都大学の神戸大朋先生と一緒に、「生命現象を駆動する生体内金属動態の理解と展開」という特集を企画させていただきました。私は銅シャペロンタンパク質に関する章を担当し、特に、CCSによるSOD1への銅イオン供給メカニズムを解説しています。また、SOD1への銅イオン供給以外にも、CCSが細胞内銅動態の制御にどのように関わっているのかについても解説し、CCSが細胞内の銅イオンレベルを感知するといった役割も紹介しました。
Original Paper 54
Amesaka H, Hara M, Sakai Y, Shintani A, Sue K, Yamanaka T, Tanaka SI*, and Furukawa Y*
“Engineering a monobody specific to monomeric Cu/Zn-superoxide dismutase associated with amyotrophic lateral sclerosis”
Protein Science 2024 Vol. 33, e4961
遺伝性の筋萎縮性側索硬化症（ALS）の発症原因として考えられている変異型銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD1）ですが、ホモ二量体として存在するSOD1の単量体化が引き金となって凝集し、運動ニューロンに毒性を発揮しているのではないかという提案があります。しかし、単量体化するのはごく一部であることから、その検出が極めて困難でした。そこで、京都府立大学の田中俊一先生と雨坂心人さんと協力して、単量体SOD1に特異的に結合する人工タンパク質（モノボディー）を開発しました。私たちが開発したモノボディーMb(S4)は、正常なSOD1ホモ二量体とは結合せず、単量体化したSOD1のみと結合する高い選択性を持っている点が大きな特徴です。実際、変異型SOD1を発現させた培養細胞や出芽酵母・大腸菌から、単量体SOD1を検出することに成功しました。今後は、モデルマウスやALS患者の検体からSOD1単量体の検出にも挑戦し、ALSの病理解明や早期診断などに貢献したいと考えています。
Mutant Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) is considered to be a cause of a familial form of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). SOD1 exists as a tight homodimer, but the monomerization of SOD1 has been proposed to trigger aggregation, exerting toxicity on motor neurons. However, since only a fraction monomerizes, their detection has been extremely challenging. In collaboration with Professor Shun-ichi Tanaka and Mr. Hiroshi Amesaka from Kyoto Prefectural University, we have developed an artificial protein (monobody) that specifically binds to monomeric SOD1. Our developed monobody, Mb(S4), is characterized by its high conformational selectivity; it does not bind to the normal SOD1 dimer, only to the monomerized SOD1. Indeed, we have successfully detected monomeric SOD1 in cultured cells, budding yeast, and E. coli expressing mutant SOD1. Going forward, we aim to detect monomeric SOD1 in model mice and ALS patients with our monobody, contributing to the elucidation of ALS pathology and the development of early diagnostics.
Review Paper 12
古川 良明*
「筋萎縮性側索硬化症における銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼの病理学的役割」
脳神経内科 2023 Vol. 99, pp. 776-781
脳神経内科という雑誌の「金属と神経疾患」という特集に寄稿させていただきました。この雑誌のターゲットはおそらく神経内科医などの医師だと思いますが、タンパク質科学的な視点からSOD1-ALSの病理について、その問題点などをまとめました。
解説記事５
古川 良明*
「化学を超えて理解する「金属」酵素の世界」
化学と教育 2023 Vol. 71, pp. 298-301
Original Paper 53
Furukawa Y*, Shintani A, Narikiyo S, Sue K, Akutsu M, and Muraki N
“Characterization of a novel cysteine-less Cu/Zn-superoxide dismutase in Paenibacillus lautus missing a conserved disulfide bond”
Journal of Biological Chemistry 2023 Vol. 299, 105040
Copper-zinc superoxide dismutase (CuZnSOD) is an enzyme that catalyzes the disproportionation of superoxide and is conserved from bacteria to humans. It binds copper and zinc ions and also forms an intramolecular disulfide bond. We have previously shown that the intramolecular disulfide bond plays a critical role in both structural stability and enzymatic activity and is therefore highly conserved in CuZnSOD. However, a close examination of CuZnSODs in the NCBI database revealed that some CuZnSODs in Paenibacillus (Gram-positive bacteria), named PaSOD, lack cysteines and are expected to have a novel domain structure. Therefore, in this study, we investigated the expression, activity and structure of PaSOD and discussed the physiological significance of the lack of cysteines in CuZnSOD in Paenibacillus.
銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（CuZnSOD）はスーパーオキシドの不均化を促進する酵素で、バクテリアからヒトまで保存されています。銅イオンと亜鉛イオンを結合し、分子内ジスルフィド結合を形成することで、タンパク質としての構造が安定化され、酵素活性を発揮します。私たちはこれまでに、分子内ジスルフィド結合が構造安定性や酵素活性に極めて重要な役割を果たしており、CuZnSODに高度に保存されていることを示してきました。しかし、米国NCBIのデータベースに登録されたCuZnSODを精査したところ、一部のPaenibacillus（グラム陽性菌）におけるCuZnSOD（PaSODと命名）はシステインを持たず、これまでに知られていない新たなドメイン構造を有していることが予想されました。そこで本研究では、PaSODの発現・活性・構造を明らかにし、なぜ、システインを持っていないのか、その意義について議論しています。
Original Paper 52
Hashimoto K, Watanabe S, Akutsu M, Muraki N, Kamishina H, Furukawa Y, and Yamanaka K*
“Intrinsic structural vulnerability in the hydrophobic core induces species-specific aggregation of canine SOD1 with degenerative myelopathy–linked E40K mutation”
Journal of Biological Chemistry 2023 Vol. 299, 104798
Press Release from Keio Univ.
Press Release from Nagoya Univ.
日本経済新聞
SOD1 mutations are one of the causes of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and mutations (E40K) in the SOD1 gene in dogs also cause degenerative myelopathy (DM), a motor neuron disease similar to ALS. Like ALS, mutation-induced amino acid substitution (E40K) is considered to affect the structure of canine SOD1 (cSOD1) and cause the disease; however, the details are not clear. In this study, Prof. Koji Yamanaka’s group at Nagoya University found that when methionine, the 117th amino acid of cSOD1, is replaced with leucine, the structural abnormality of cSOD1 caused by E40K mutation is not observed. Therefore, our group performed crystallographic analysis to clarify the reason why the E40K-cSOD1 structural abnormality is not observed by the M117L mutation. As a result, the methionine is located in the hydrophobic core of the cSOD1 structure but also creates a void in its vicinity. On the other hand, substitution of leucine, a hydrophobic amino acid slightly larger in size than methionine, was found to fill the void exactly (see figure below), which is considered to result in the structural stabilization of cSOD1. Since the 117th amino acid in human SOD1 is leucine, canine SOD1 is more structurally unstable than human SOD1 and also more vulnerable to amino acid substitutions such as E40K.
SOD1遺伝子変異は筋萎縮性側索硬化症（ALS）の発症原因の一つですが、イヌにおいてもSOD1遺伝子に変異（E40K）があると、ALSに類似した運動ニューロン疾患である変性性脊髄症（DM）を発症します。ALSと同じように、変異に伴うアミノ酸置換（E40K）がイヌSOD1（cSOD1）の構造に影響を及ぼし、DMを発症させると考えられていますが、詳細は明らかでありません。今回、名古屋大学の山中宏二先生のグループは、cSOD1の117番目のアミノ酸であるメチオニンをロイシンに置換すると、E40K変異によるcSOD1の構造異常が見られなくなることを見出しました。そこで、私たちのグループでは、M117L変異がcSOD1の構造に及ぼす影響を明らかにするために、結晶構造解析を行いました。その結果、メチオニンはcSOD1構造のコアとなる疎水的な領域に位置しており、その近傍に空隙が生じていることがわかりました。一方で、メチオニンよりもサイズが少し大きな疎水性アミノ酸であるロイシンに置換すると、その空隙がピタリと埋まり（下図）、cSOD1のコア構造が安定化されることが考えられました。ヒトのSOD1は117番目のアミノ酸がもともとロイシンであることを考えると、イヌのSOD1はヒトのSOD1よりも構造的に不安定で、E40Kのようなアミノ酸置換によって構造が異常化しやすいのではないかと提案することができました。
Original Paper 51
Furukawa Y*, Matsumoto K, Nakagome K, Shintani A, and Sue K
“Zinc-mediated interaction of copper chaperones through their heavy-metal associated domains”
Journal of Trace Elements in Medicine and Biology 2023 Vol.75, 127111
Our study on copper chaperones has been published in Journal of Trace Elements in Medicine and Biology (IF = 3.995). A copper chaperone for superoxide dismutase, CCS, is known to be responsible for delivering a copper ion to superoxide dismutase (SOD1), but we have shown that CCS can interact with another copper chaperone, HAH1, through a zinc ion. This study has actually a long history (almost 10 years?) in our lab and is an achievement of the struggles by Mr. Nakagome and Ms. Matsumoto. It is quite interesting that distinct copper-delivering proteins (i.e. copper chaperones) interact with each other through a zinc (but not copper) ion. Nonetheless, the interaction is relatively weak, and its physiological relevance remains obscure. We still have a lot of work to do!
銅シャペロンに関する私たちの研究が、Journal of Trace Elements in Medicine and Biology (IF = 3.995)に掲載されました。CCSという銅シャペロンタンパク質は、SOD1に銅イオンを運ぶ役割を担っていますが、別の銅シャペロンタンパク質であるHAH1と亜鉛イオンを介して相互作用することを見出しました。この研究を始めてから10年近く経ってしまいましたが、卒業生の中込君や松本さんの奮闘もあって、なんとか形にすることができました。銅イオンを運ぶタンパク質が亜鉛イオンを介して相互作用するというのは非常に面白いと思うのですが、相互作用は比較的弱く、その生理的意義は不明のままです。まだまだやるべきことが残っているということでしょうか。
Original Paper 50
Moriyama Y, Ogata G, Nashimoto H, Sawamura S, Furukawa Y, Hibino H, Kusuhara H, and Einaga Y*
“A rapid and simple electrochemical detection of the free drug concentration in human serum using boron-doped diamond electrodes”
Analyst 2022 Vol. 147, pp. 4442-4449
Review Paper 11
Furukawa Y*
“A pathological link between dysregulated copper binding in Cu/Zn-superoxide dismutase and amyotrophic lateral sclerosis”
Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition 2022 Vol. 71, pp. 73-77
This review summarizes the copper and zinc binding process of SOD1 in vivo, based upon which possible dysregulation of such metal binding processes is discussed as a pathomechanism of SOD1-related amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Furthermore, a copper chaperone for SOD1, which is responsible for supplying a copper ion to SOD1 in vivo, is discussed as a potential target for developing ALS therapeutics.
本総説では、生体内におけるSOD1への銅・亜鉛イオンの結合過程についてまとめたうえで、金属イオン結合過程における制御異常が、SOD1の関与する筋萎縮性側索硬化症（ALS）の病態を形成している可能性について述べています。また、SOD1に銅イオンを供給する銅シャペロンが、ALS治療薬を開発する上での重要なターゲットになりうることを議論しています。
Original Paper 49
Imamura Y, Okuzumi A, Yoshinaga S, Hiyama A, Furukawa Y, Miyasaka T, Hattori N, and Nukina N*
“Quantum-dot-labeled synuclein seed assay identifies drugs modulating the experimental prion-like transmission”
Communications Biology 2022 Vol. 5, 636
本論文は、貫名 信行 先生（同志社大学）のグループで進められている研究で、パーキンソン病などの原因タンパク質であるα-synucleinの線維が生体内でどのように伝播していくのかを理解するための研究で、その伝播を制御する薬剤に関する結果が報告されています。私たちは、本論文で用いられたα-synuclein線維の構造情報について、FT-IRなどを使って検討させていただきました。
Original Paper 48
Tajiri M, Aoki H, Shintani A, Sue K, Akashi S*, and Furukawa Y*
“Metal distribution in Cu/Zn-superoxide dismutase revealed by native mass spectrometry”
Free Radical Biology and Medicine 2022 Vol. 183, pp. 60-68
SOD1はホモ二量体として存在する金属タンパク質で、それぞれのサブユニットでは、活性部位として機能する銅イオンを結合するとともに、タンパク質構造の安定化を担う亜鉛イオンが結合します。一方、生体試料から単離・精製すると、化学量論量とは異なる割合で銅・亜鉛イオンを結合しているSOD1（金属異常型）が得られることがよくあります。特に、筋萎縮性側索硬化症（ALS）では、SOD1と金属イオンとの結合親和性が低下し、タンパク質構造の異常化（ミスフォールド）が進行することで、疾患が発症するのではないかと提案されています。そこで、横浜市立大学の明石知子教授・田尻道子博士と共同研究を進め、銅・亜鉛イオンがSOD1分子内にどのように分布して結合しているのかをネイティブ質量分析により検討したところ、それぞれの金属イオンがそれぞれの結合部位に正確に結合するには、SOD1に保存されたジスルフィド結合が還元されている必要があることがわかりました。つまり、ALSに見られる金属異常型SOD1は、ジスルフィド形成の制御異常によって生じると考えられ、特に、細胞内レドックスの状態変化がALSの発症に関与しているのではないかと推察されます。
Original Paper 47
Kimura S, Kamishina H, Hirata Y, Furuta K, Furukawa Y, Yamato O, Maeda S, and Kamatari YO*
“Novel oxindole compounds inhibit the aggregation of amyloidogenic proteins associated with neurodegenerative diseases”
Biochimica et Biophysica Acta 2022 Vol.1866, 130114
Press Release from Gifu Univ.
Press Release from Keio Univ.
岐阜新聞
岐阜大学の鎌足先生との共同研究で、オキシインドール構造からなる一連のGIF化合物が、イヌの変性性脊髄症やヒトの筋萎縮性側索硬化症（ALS）の原因タンパク質であるSOD1の凝集を抑制することを示すことができました。また、プリオン病の原因タンパク質であるプリオンタンパク質(PrP)を含む複数の神経変性疾患原因タンパク質においても、凝集抑制効果がみられたことから、GIF化合物はタンパク質の異常型構造と相互作用することで凝集抑制に効果を発揮し、ヒトや動物の神経変性疾患の治療への応用が期待されます。私たちは、ヒトSOD1の野生型およびALS変異型タンパク質を調製し、凝集抑制試験に提供させていただきました。
Original Paper 46
Furukawa Y*, Shintani A, Kokubo T
“A dual role of cysteine residues in the maturation of prokaryotic Cu/Zn-superoxide dismutase”
Metallomics 2021 Vol.13, mfab050
Previously, our group showed that the conserved disulfide bond of Cu/Zn-superoxide dismutase plays critical roles in the structural stabilization. In our newly published study with E. coli Cu/Zn-superoxide dismutase (SodC), we have revealed that prior to the disulfide formation, the thiolates of the Cys residues can capture copper ions with extremely high affinity. We hence suppose that the conserved Cys residues play a dual role: acquisition of a copper ion and formation of the disulfide bond.
銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼには、高度に保存された分子内ジスルフィド（S-S）結合が形成していますが、私たちはS-S結合の形成がタンパク質構造の安定化に必須であることをこれまでに示してきました。今回の研究では、大腸菌由来の銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SodC）に着目し、S-S結合が形成する前のシステイン残基におけるチオレート基が、銅イオンや亜鉛イオンの獲得に重要であることを示しました。つまり、SodCのシステイン残基は、「金属イオンの獲得」とS-S結合形成を通じた「タンパク質構造の安定化」という、二重の役割を有していることを提案しています。
Original Paper 45
Hirose M, Asano M, Watanabe-Matsumoto S, Yamanaka K, Abe Y, Yasui M, Tokuda E, Furukawa Y, and Misawa H*
“Stagnation of glymphatic interstitial fluid flow and delay in waste clearance in the SOD1-G93A mouse model of ALS”
Neuroscience Research 2020 Vol. 171, pp. 74-82
体の中で生じる老廃物を排せつ・処理するためにリンパ系が全身に張り巡らされていることはよく知られていますが、不思議なことに、脳や脊髄といった中枢神経系にはリンパ系が見つかっていませんでした。しかし、最近になって、中枢神経系に生じた老廃物は、脳脊髄液の流れを利用したシステム（脳リンパ流：glymphatic system）によって除去されることが提案されています。今回、薬学部の三澤教授は、脳リンパ流を発生させる水チャネルAQP4に着目し、AQP4をノックアウトすることで脳リンパ流の流れを悪くすると、変異型SOD1の凝集体（老廃物）が脳・脊髄から除去される効率が低下し、筋萎縮性側索硬化症（ALS）の発症につながるメカニズムを提唱しました。本研究は、慶應義塾大学次世代研究プロジェクトの支援を受けたもので、医学部の安井教授とともに、古川も変異型SOD1凝集体の提供・解析という面で協力させていただきました。
Review Paper 10
古川 良明*
「神経変性疾患における銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼのミスフォールディング」
生物物理 2020 Vol.60 pp.338-341
神経変性疾患ALSにおけるSOD1タンパク質のミスフォールディングについて、「生物物理」誌に総説を発表しました。
解説記事４
古川 良明*
「私の研究は「化学」なのか？」
Newsletter 日本化学会 生体機能関連化学部会 2020 Vol. 35, pp. 4-5
Review Paper 9
Furukawa Y*
“Good and bad of Cu/Zn-superoxide dismutase controlled by metal ions and disulfide bonds”
Chemistry Letters 2020 Vol. 50, pp. 331-341
This review summarizes intracellular processes for metal binding and disulfide formation in SOD1, both of which are essential to stabilization of the protein structure as well as its enzymatic function. Also, failure of those processes as a possible cause of a neurodegenerative disease through protein misfolding will be described.
SOD1タンパク質における金属イオンの結合とジスルフィド結合の形成は、酵素活性の発現だけではなく、タンパク質構造の安定化にも必要です。また、金属イオンやジスルフィド結合が正確に導入されないと、SOD1はミスフォールド（構造異常化）して、神経変性疾患の発症につながります。本総説では、これまでに古川が行ってきたSOD1に関する研究をまとめました。
Review Paper 8
Furukawa Y* and Tokuda E
“Does wild-type Cu/Zn-superoxide dismutase have pathogenic roles in amyotrophic lateral sclerosis?”
Translational Neurodegeneration 2020 Vol. 9 Article 33
Mutations in the gene coding Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) have been detected in a part of familial forms of ALS, and abnormal accumulation of misfolded mutant SOD1 in affected spinal motor neurons has been established as a pathological hallmark of ALS caused by mutations in SOD1 (SOD1-ALS). Nonetheless, involvement of wild-type SOD1 remains quite controversial in the pathology of ALS with no SOD1 mutations (non-SOD1 ALS), which occupies more than 90% of total ALS cases. We reviewed pathological studies on mouse models and patients and then summarized arguments for and against possible involvement of wild-type SOD1 in non-SOD1 ALS as well as in SOD1-ALS.
銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD1）をコードする遺伝子に変異が生じると、神経変性疾患の一種である筋萎縮性側索硬化症（ALS）を発症することが知られています。しかし、SOD1遺伝子変異を原因とするALSは全症例の数％にすぎず、ほとんどの症例では原因が不明の孤発例です。私たちを含めたいくつかの研究グループから、孤発性ALSにおいても野生型SOD1の構造異常が検出されるという報告がなされていますが、野生型SOD1の関与を全く支持しない報告もあり、見解が明確に分かれています。そこで、孤発性ALSにおける野生型SOD1の病理学的役割について、これまでの研究を網羅的に調査し、賛否両論が生じる理由を探りました。
Original Paper 44
Anzai I, Tokuda E, Handa S, Misawa H, Akiyama S, and Furukawa Y*
“Oxidative misfolding of Cu/Zn-superoxide dismutase triggered by non-canonical intramolecular disulfide formation”
Free Radical Biology and Medicine 2020 Vol. 147 pp.187-199
Press Release from Keio Univ.
Press Release from IMS
客觀日本による記事（中国語）
A dominant mutation in a gene coding Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) is the first described genetic cause for familial ALS. SOD1-related ALS cases are characterized by abnormal accumulation of misfolded SOD1 proteins in motoneurons. Many researchers believe that elucidation of the SOD1 misfolding will contribute to the understanding of ALS pathogenesis; however, it still remains controversial how SOD1 misfolds in pathological conditions. In this study, a new mechanism of SOD1 misfolding has been proposed, which is characterized by the demetallation-triggered formation of a non-canonical intramolecular disulfide bond in oxidizing environment. The misfolded SOD1 with such a newly identified abnormal conformation was found to exhibit significant cytotoxicity as well as high propensity to aggregate. ALS patients are known to show marked elevation in several markers of oxidative damages; therefore, the oxidative misfolding of SOD1 we have proposed will be important in understanding the SOD1-related ALS pathomechanism.
筋萎縮性側索硬化症（ALS）の発症に関わる銅・亜鉛イオン結合タンパク質SOD1について、その立体構造が異常化する新たなメカニズムを提唱しました。SOD1をコードする遺伝子に変異が生じると、異常な立体構造をしたSOD1が運動ニューロンに蓄積し、ALSを発症させることが提案されています。SOD1の構造がどのようなきっかけで異常化するかは未だ明確ではありませんが、酸化されたSOD1から銅・亜鉛イオンが解離すると、毒性を有した異常構造に変化することを見出しました。多くのALS患者では酸化ストレスの増大と金属イオン動態の異常化が報告されていることからも、本研究における提案は、SOD1が関与するALSの発症メカニズムを考える上で重要です。
Original Paper 43
Tokuda E, Takei Y, Ohara S, Fujiwara N, Hozumi I, and Furukawa Y*
“Wild-type Cu/Zn-superoxide dismutase is misfolded in cerebrospinal fluid of sporadic amyotrophic lateral sclerosis”
Molecular Neurodegeneration 2019 Vol.14 42
Press Release from Keio Univ.
時事通信社の記事
日経産業新聞（12/10朝刊6面）
There are currently no cures for the neurodegenerative disease ALS. In 1993, SOD1 was identified as a causative gene for familial ALS cases, and misfolded mutant SOD1 is known to abnormally accumulate in degenerating motor neurons. Nonetheless, SOD1 mutations are found in only 2% of total ALS cases. Because a pathogenic mutation is not a prerequisite for the misfolding of SOD1 in vitro, much effort has been made for the detection of misfolded wild-type SOD1 in ALS patients without SOD1 mutations. Here, we found for the first time that wild-type SOD1 was misfolded specifically in the cerebrospinal fluid (CSF) of sporadic ALS cases. More importantly, we showed that the misfolded wild-type SOD1 in the CSF was toxic to motor neuron-like cells. We thus believe that our manuscript will provide important insights into the development of therapeutics for sporadic ALS.
神経難病の一つで、原因遺伝子が明らかでない孤発性の筋萎縮性側索硬化症（ALS）において、患者の脳脊髄液ではSOD1と呼ばれるタンパク質の構造が異常化していることを発見しました。また、ALS患者の脳脊髄液は極めて高い細胞毒性を発揮し、その毒性は構造異常型のSOD1タンパク質に起因することを見出しました。実際、脳脊髄液から構造異常型のSOD1タンパク質を除去すると、運動ニューロン様の培養細胞に対する毒性が大幅に軽減しました。これまでは、ALSの主要な病変部位である脊髄に研究の焦点が置かれてきましたが、本研究は、脳脊髄液におけるSOD1タンパク質がALSの病態に関与している可能性を示すもので、治療法の開発に向けた新たな一歩になることが期待されます。
Original Paper 42
Tanaka G, Yamanaka T, Furukawa Y, Kajimura N, Mitsuoka K, and Nukina N*
“Sequence- and seed-structure-dependent polymorphic fibrils of alpha-synuclein”
Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease 2019 Vol.1865 pp.1410-1420