研究成果(2011-2013)

Original Paper 25
Furukawa Y*
“Redox environment is an intracellular factor to operate distinct pathways for aggregation of Cu,Zn-superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosis”
Frontiers in CELLULAR NEUROSCIENCE 2013 Vol.7 Article 240 

We have focused upon aggregation of mutant Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1), which associates with a familial form of amyotrophic lateral sclerosis (fALS). Increased oxidative stress has been reported in fALS patients, and SOD1 appears to be one of intracellular targets susceptible to oxidative modifications. While reduction of a disulfide bond in SOD1 has been proposed to trigger the aggregation, a disulfide-reduced form of SOD1 would not stably exist under pathological conditions with oxidative stress. In this study, E. coli has been used as a model organism to show multiple distinct pathways of SOD1 aggregation that are dependent upon its thiol-disulfide status.

(私たちの研究室では、神経変性疾患ALSに関わるSOD1タンパク質の凝集メカニズムについて研究を進めています。SOD1には分子内ジスルフィド結合が形成し、タンパク質構造の安定化に寄与しています。ジスルフィド結合が還元して切断されると構造が不安定となることで、SOD1は凝集しやすくなることを報告してきましたが、ALS患者は高い酸化ストレスを受けていることが知られています。そのような酸化的な環境下でジスルフィド結合は還元されるのでしょうか?本研究では、大腸菌をモデルとして用いて、細胞内レドックス環境に依存して異なる別個のSOD1凝集経路が存在することを明らかにしました。) 

Original Paper 24
Furukawa Y*, Kaneko K, Watanabe S, Yamanaka K, and Nukina N
“Intracellular seeded aggregation of mutant Cu,Zn-superoxide dismutase associated with amyotrophic lateral sclerosis”
FEBS Letters 2013 Vol.587 pp.2500-2505 

Mutations in SOD1 gene cause a neurodegenerative disease, ALS. So far, we have investigated effects of pathogenic mutations on SOD1 structures and revealed a molecular mechanism describing that mutant SOD1 forms insoluble fibrillar aggregates. Once a protein adopts the fibrillar aggregate conformation, a seeding reaction becomes operative in which pre-formed fibrils function as seeds for soluble protein molecules to be fibrillized. We show that in vitro SOD1 fibrils are transduced into cells and function as seeds to trigger the aggregation of endogenously expressed SOD1. This study provides a molecular description on how pathological changes are propagated in this disease.

(SOD1タンパク質にアミノ酸変異が導入さ れると、神経変性疾患の一種であるALSの原因になることが知られています。これまでに私たちは、変異SOD1が不溶性で線維状の凝集体を形成する分子メカニズムを明らかにしてきました。タンパク質からなる線維状凝集体は、それ自体がシード(種)となってタンパク質の線維化を促進します(シーディング反応)。そこで、試験管内で作製したSOD1の線維を培養細胞に導入すると、細胞内でシーディング反応が進行し、細胞内に発現していた可溶性SOD1が凝集してしまうことが分かりました。 シーディング反応は、ALSの病状進行を説明する分子メカニズムの一つではないかと考えています。) 

Review Paper 3
Furukawa Y* and Nukina N*
“Functional diversity of protein fibrillar aggregates from physiology to RNA granules to neurodegenerative diseases”
Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease 2013 Vol.1832 pp.1271-1278 

Many proteins exhibit propensities to form fibrillar aggregates called amyloids that are rich in β-sheet structures. Abnormal accumulation of amyloids in brain and spinal cords is well known as a major pathological change in neurodegenerative diseases; therefore, amyloids have long been considered as disease culprits formed via protein misfolding and should be avoided in healthy cells. Recently, however, increasing numbers of proteins have been identified that require formation of fibrillar states for exertion of their physiological functions, and critical roles of such functional amyloids include a molecular switch for environmental adaptation, a structural template for catalysis, and a regulator of intracellular signaling. Protein amyloids will, therefore, be more prevailed in our physiologies than we have expected so far. Here, we have reviewed recent studies on such regulatory roles of protein fibrillar aggregates in various physiologies and further discussed possible relations of functional to pathological amyloids.

(タンパク質はその構造を変化させて、非常に規則的な会合体を形成することがあります。特にβ-sheetと呼ばれるシート状の構造がつながって繊維のような形態を有する会合体を「アミロイド」と呼びます。アミロイドは不溶性で、アルツハイマー病やパーキンソン病といった多くの神経変性疾患の患者の脳や神経組織に異常に蓄積していることが報告されています。アミロイドが病気の原因なのか結果なのかは未だに議論の余地がありますが、様々な生命現象を脅かす厄介な存在として考えられてきました。しかし近年では、生体はタンパク質のアミロイド化を積極的に利用して、幾つかの生理的反応を司っていることが分かってきました(機能的アミロイド)。そこで、病理的なアミロイドと機能的なアミロイドについての最近の研究を紹介し、両者をつなぐ接点としてRNA granulesという構造物を取り上げています。) 

Original Paper 23
Toichi K, Yamanaka K, and Furukawa Y*
“Disulfide scrambling describes the oligomer formation of SOD1 proteins in the familial form of ALS”
The Journal of Biological Chemistry 2013 Vol.288 pp.4970-4980 

Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) regulates various physiological and pathological processes by catalyzing the disproportionation of superoxide radicals. It is notable that more than 100 mutations in SOD1 gene have been identified as a cause of familial forms of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), a devastating neurodegenerative disease. It remains unclear how mutations in SOD1 result in the selective death of motor neurons, but abnormal accumulation of mutant SOD1 proteins as insoluble aggregates has been considered as a key to understand the pathomechanism of ALS. Toichi-kun in our lab has noted the disulfide bond in SOD1 and successfully reproduced the formation of abnormal SOD1 structures in test tubes. Our current study has revealed a brand-new mechanism: mutations in SOD1 destabilize the native structure of SOD1, which facilitates the “scrambling” of a disulfide bond and thereby cross-links SOD1 molecules. From a library of drugs, we are now screening drugs that can suppress such a disulfide scrambling process.

(銅・亜鉛スーパーオキサイドディスムターゼ (SOD1)はスーパーオキサイドの不均化を触媒する酵素で、様々な生理・病理に関わる重要なタンパク質です。特に、SOD1タンパク質へのアミノ酸変異は、家族性の筋萎縮性側索硬化症(神経変性疾患の一つ、ALS)の原因として知られています。詳細な発症メカニズムについては明らかでありませんが、患者の脊髄運動神経には変異SOD1タンパク質が不溶性の凝集体として蓄積しているため、アミノ酸変異に伴うSOD1タンパク質の構造異常がALS発症に関与しているのではないかと考えられています。修士2年の東一君は、SOD1タンパク質の分子内に形成する「ジスルフィド結合」に着目し、変異SOD1の異常型構造を試験管内で再現することに成功しました。アミノ酸変異によってSOD1構造が不安定となり、ジスルフィド結合の位置が移動し、SOD1分子同士をクロスリンクしてしまうことが分かりました。その様は、まるで日本の伝承玩具の「はしごすべり」を想起させます。現在は、SOD1異常型構造の形成を阻止する薬剤のスクリーニングを行っており、ALSの予防・治療薬開発につなげることができればと考えています。 ) 

Original Paper 22
Ding F, Furukawa Y, Nukina N, and Dokholyan NV* 
“Local unfolding of Cu,Zn Superoxide Dismutase monomer determines the morphology of fibrillar aggregates”
Journal of Molecular Biology 2012 Vol.421 pp.548-560 

Book Chapter 3
Furukawa Y*
“Protein aggregates in pathological inclusions of amyotrophic lateral sclerosis”
Chapter 14 in Amyotrophic lateral sclerosis, InTech (Martin H. Maurer Ed.) 2012 

Review Paper 2
Furukawa Y
“Pathological Roles of Wild-Type Cu, Zn-Superoxide Dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis”
Neurology Research International 2012 Article ID:323261 

Mutations in SOD1 have been known to cause a neurodegenerative disease called ALS. Recently, several studies have proposed that wild-type (i.e. no mutations) SOD1 also undergoes some conformational changes in sporadic forms of ALS; however, researchers have yet to reach a consensus upon the involvement of wild-type SOD1 in the pathomechanism of ALS. We have summarized recent reports on possible links between wild-type SOD1 and ALS.

(SOD1 遺伝子に生じる優性変異はALSと呼ばれる神経変性疾患の原因となりますが、実際には、SOD1遺伝子には変異が認められない症例の方が圧倒的に多く存在します。興味深いことに、野生型(つまり変異がないという意味)SOD1であっても、生体内の環境に応じて異常なタンパク質構造を形成することがあり、それらがALS発症に寄与しているのではないかと提案されています。そこで、ALS病態における野生型SOD1についての研究をまとめました。) 

Original Paper 21
Mitomi Y, Nomura T, Kurosawa M, Nukina N, and Furukawa Y
“Post-aggregation oxidation of mutant huntingtin controls the interactions between aggregates”
The Journal of Biological Chemistry 2012 Vol.287 pp.34764-34775 

To reveal an unprecedented role of modifications in protein aggregation, we focus upon a protein, huntingtin (HTT), which has been known to form insoluble aggregates in a neurodegenerative disorder, Huntington disease (HD). By examining aggregation of recombinant HTT proteins, we have for the first time identified oxidation of a Met residue in HTT during the aggregation in vitro and in vivo, and more interestingly, this Met oxidation occurred only in the aggregated HTT but not in the soluble state. Furthermore, we have found that the Met oxidation creates additional interactions among HTT aggregates and alters those overall morphologies. We thus propose that such a “post-aggregation” modification is a relevant factor to regulate properties of protein aggregates.

(タンパク質の不溶性凝集は、多くの神経変性 疾患における主要な病理変化として観察されます。 凝集体の構成タンパク質には様々な化学修飾が施されることがあり、タンパク質凝集の制御因子として頻繁に議論されています。 しかし、化学修飾がタンパク質の凝集プロセスにどのように関わっているのか、その役割が明確となっている例はあまりありません。 そこで修士2年の三冨君は、ハンチントン病に見られる変異ハンチンチン(HTT)凝集体に着目して、タンパク質凝集における化学修飾の新たな役割について検討しました。 まず、三冨君は精製した変異HTTタンパク質から不溶性凝集体を作製し、質量分析法を応用することで、メチオニン残基が酸化されていることを初めて見出しました。 メチオニン残基の酸化は、変異HTTが凝集した後にのみ進行し、野生型HTTには生じない修飾プロセスでした。 さらに、光散乱解析や電子顕微鏡観察を行うことで、HTT凝集体のサイズがメチオニン酸化に伴って増大することが明らかとなりました。 つまり、化学修飾はタンパク質の凝集後にも生じるプロセスであり、凝集体間の相互作用を制御しうる因子であることが示唆されました。)

Original Paper 20
Furukawa Y*, Kaneko K, and Nukina N* 
“Molecular properties of TAR DNA binding protein-43 fragments are dependent upon its cleavage site”
Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease 2011 Vol.1812 pp.1577-1583 

Original Paper 19
Furukawa Y*, Kaneko K, and Nukina N* 
“Tau protein assembles into isoform- and disulfide-dependent polymorphic fibrils with distinct structural properties”
The Journal of Biological Chemistry 2011 Vol.286 pp.27236-27246

多くの神経変性疾患では、その病変部位(脳・脊髄などの神経組織)に線維状のタンパク質凝集体の異常蓄積が認められます。特に、タウと呼ばれるタンパク質の線維が観察される神経変性疾患はタウオパチーと呼ばれ、その中にはアルツハイマー病(記憶障害)やピック病(人格障害)などが含まれます。興味深いことに、病変部位に観 察されるタウ線維の形態は、症状によって大きく異なることが報告されています。しかし、タウがどのような形態を有する線維となるのか、その制御メカニズムについては明らかでありませんでした。本研究で私たちは、タウに存在するシステイン残基に着目し、それらがジスルフィド結合を形成するか 否かによって、線維の形態が全く異なることを明らかにしました。つまり、タウオパチーにみられる症状の多様性は、ジスルフィド結合依存的なタウ線維の形態多様性によって説明できるのではないかと考えています。

Original Paper 18
Furukawa Y*, Kaneko K, Watanabe S, Yamanaka K, and Nukina N* 
“A seeding reaction recapitulates intracellular formation of Sarkosyl-insoluble transactivation response element (TAR) DNA-binding Protein-43 Inclusions”
The Journal of Biological Chemistry 2011 Vol.286 pp.18664-18672 
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神経変性疾患に観察されるタンパク質線維は「感染」能力を持っています。つまり、タンパク質の水溶液にタンパク質線維を少しだけ混入させると、線維が核となることで、水溶性だったタンパク質が急速に線維化します。これは、食塩の水溶液に種結晶を入れると、結晶化が一気に進む現象とよく似ており、どちらもシーディングと呼ばれます。では、タンパク質線維化のシーディングは、生体内でも起きるのでしょうか?私たちは、細胞内にタンパク質の線維を導入する手法を開発し、細胞内でのシーディングを再現することに成功しました。このことは、体内で線維が形成すると、線維化が一気に進行し組織に拡がることを暗示しており、発症から急速に症状が悪化する神経変性疾患の特徴をよくとらえた分子現象であるといえます。本論文はJBC誌のPaper of the Weekに選ばれました。