Original Paper 45
Hirose M, Asano M, Watanabe-Matsumoto S, Yamanaka K, Abe Y, Yasui M, Tokuda E, Furukawa Y, and Misawa H*
“Stagnation of glymphatic interstitial fluid flow and delay in waste clearance in the SOD1-G93A mouse model of ALS”
Neuroscience Research 2020 Vol. 171, pp. 74-82
体の中で生じる老廃物を排せつ・処理するためにリンパ系が全身に張り巡らされていることはよく知られていますが、不思議なことに、脳や脊髄といった中枢神経系にはリンパ系が見つかっていませんでした。しかし、最近になって、中枢神経系に生じた老廃物は、脳脊髄液の流れを利用したシステム（脳リンパ流：glymphatic system）によって除去されることが提案されています。今回、薬学部の三澤教授は、脳リンパ流を発生させる水チャネルAQP4に着目し、AQP4をノックアウトすることで脳リンパ流の流れを悪くすると、変異型SOD1の凝集体（老廃物）が脳・脊髄から除去される効率が低下し、筋萎縮性側索硬化症（ALS）の発症につながるメカニズムを提唱しました。本研究は、慶應義塾大学次世代研究プロジェクトの支援を受けたもので、医学部の安井教授とともに、古川も変異型SOD1凝集体の提供・解析という面で協力させていただきました。
Review Paper 10
古川 良明*
「神経変性疾患における銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼのミスフォールディング」
生物物理 2020 Vol.60 pp.338-341
神経変性疾患ALSにおけるSOD1タンパク質のミスフォールディングについて、「生物物理」誌に総説を発表しました。
解説記事４
古川 良明*
「私の研究は「化学」なのか？」
Newsletter 日本化学会 生体機能関連化学部会 2020 Vol. 35, pp. 4-5
Review Paper 9
Furukawa Y*
“Good and bad of Cu/Zn-superoxide dismutase controlled by metal ions and disulfide bonds”
Chemistry Letters 2020 Vol. 50, pp. 331-341
This review summarizes intracellular processes for metal binding and disulfide formation in SOD1, both of which are essential to stabilization of the protein structure as well as its enzymatic function. Also, failure of those processes as a possible cause of a neurodegenerative disease through protein misfolding will be described.
SOD1タンパク質における金属イオンの結合とジスルフィド結合の形成は、酵素活性の発現だけではなく、タンパク質構造の安定化にも必要です。また、金属イオンやジスルフィド結合が正確に導入されないと、SOD1はミスフォールド（構造異常化）して、神経変性疾患の発症につながります。本総説では、これまでに古川が行ってきたSOD1に関する研究をまとめました。
Review Paper 8
Furukawa Y* and Tokuda E
“Does wild-type Cu/Zn-superoxide dismutase have pathogenic roles in amyotrophic lateral sclerosis?”
Translational Neurodegeneration 2020 Vol. 9 Article 33
Mutations in the gene coding Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) have been detected in a part of familial forms of ALS, and abnormal accumulation of misfolded mutant SOD1 in affected spinal motor neurons has been established as a pathological hallmark of ALS caused by mutations in SOD1 (SOD1-ALS). Nonetheless, involvement of wild-type SOD1 remains quite controversial in the pathology of ALS with no SOD1 mutations (non-SOD1 ALS), which occupies more than 90% of total ALS cases. We reviewed pathological studies on mouse models and patients and then summarized arguments for and against possible involvement of wild-type SOD1 in non-SOD1 ALS as well as in SOD1-ALS.
銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD1）をコードする遺伝子に変異が生じると、神経変性疾患の一種である筋萎縮性側索硬化症（ALS）を発症することが知られています。しかし、SOD1遺伝子変異を原因とするALSは全症例の数％にすぎず、ほとんどの症例では原因が不明の孤発例です。私たちを含めたいくつかの研究グループから、孤発性ALSにおいても野生型SOD1の構造異常が検出されるという報告がなされていますが、野生型SOD1の関与を全く支持しない報告もあり、見解が明確に分かれています。そこで、孤発性ALSにおける野生型SOD1の病理学的役割について、これまでの研究を網羅的に調査し、賛否両論が生じる理由を探りました。
Original Paper 44
Anzai I, Tokuda E, Handa S, Misawa H, Akiyama S, and Furukawa Y*
“Oxidative misfolding of Cu/Zn-superoxide dismutase triggered by non-canonical intramolecular disulfide formation”
Free Radical Biology and Medicine 2020 Vol. 147 pp.187-199
Press Release from Keio Univ.
Press Release from IMS
客觀日本による記事（中国語）
A dominant mutation in a gene coding Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) is the first described genetic cause for familial ALS. SOD1-related ALS cases are characterized by abnormal accumulation of misfolded SOD1 proteins in motoneurons. Many researchers believe that elucidation of the SOD1 misfolding will contribute to the understanding of ALS pathogenesis; however, it still remains controversial how SOD1 misfolds in pathological conditions. In this study, a new mechanism of SOD1 misfolding has been proposed, which is characterized by the demetallation-triggered formation of a non-canonical intramolecular disulfide bond in oxidizing environment. The misfolded SOD1 with such a newly identified abnormal conformation was found to exhibit significant cytotoxicity as well as high propensity to aggregate. ALS patients are known to show marked elevation in several markers of oxidative damages; therefore, the oxidative misfolding of SOD1 we have proposed will be important in understanding the SOD1-related ALS pathomechanism.
筋萎縮性側索硬化症（ALS）の発症に関わる銅・亜鉛イオン結合タンパク質SOD1について、その立体構造が異常化する新たなメカニズムを提唱しました。SOD1をコードする遺伝子に変異が生じると、異常な立体構造をしたSOD1が運動ニューロンに蓄積し、ALSを発症させることが提案されています。SOD1の構造がどのようなきっかけで異常化するかは未だ明確ではありませんが、酸化されたSOD1から銅・亜鉛イオンが解離すると、毒性を有した異常構造に変化することを見出しました。多くのALS患者では酸化ストレスの増大と金属イオン動態の異常化が報告されていることからも、本研究における提案は、SOD1が関与するALSの発症メカニズムを考える上で重要です。
Original Paper 43
Tokuda E, Takei Y, Ohara S, Fujiwara N, Hozumi I, and Furukawa Y*
“Wild-type Cu/Zn-superoxide dismutase is misfolded in cerebrospinal fluid of sporadic amyotrophic lateral sclerosis”
Molecular Neurodegeneration 2019 Vol.14 42
Press Release from Keio Univ.
時事通信社の記事
日経産業新聞（12/10朝刊6面）
There are currently no cures for the neurodegenerative disease ALS. In 1993, SOD1 was identified as a causative gene for familial ALS cases, and misfolded mutant SOD1 is known to abnormally accumulate in degenerating motor neurons. Nonetheless, SOD1 mutations are found in only 2% of total ALS cases. Because a pathogenic mutation is not a prerequisite for the misfolding of SOD1 in vitro, much effort has been made for the detection of misfolded wild-type SOD1 in ALS patients without SOD1 mutations. Here, we found for the first time that wild-type SOD1 was misfolded specifically in the cerebrospinal fluid (CSF) of sporadic ALS cases. More importantly, we showed that the misfolded wild-type SOD1 in the CSF was toxic to motor neuron-like cells. We thus believe that our manuscript will provide important insights into the development of therapeutics for sporadic ALS.
神経難病の一つで、原因遺伝子が明らかでない孤発性の筋萎縮性側索硬化症（ALS）において、患者の脳脊髄液ではSOD1と呼ばれるタンパク質の構造が異常化していることを発見しました。また、ALS患者の脳脊髄液は極めて高い細胞毒性を発揮し、その毒性は構造異常型のSOD1タンパク質に起因することを見出しました。実際、脳脊髄液から構造異常型のSOD1タンパク質を除去すると、運動ニューロン様の培養細胞に対する毒性が大幅に軽減しました。これまでは、ALSの主要な病変部位である脊髄に研究の焦点が置かれてきましたが、本研究は、脳脊髄液におけるSOD1タンパク質がALSの病態に関与している可能性を示すもので、治療法の開発に向けた新たな一歩になることが期待されます。
Original Paper 42
Tanaka G, Yamanaka T, Furukawa Y, Kajimura N, Mitsuoka K, and Nukina N*
“Sequence- and seed-structure-dependent polymorphic fibrils of alpha-synuclein”
Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease 2019 Vol.1865 pp.1410-1420
Review Paper 7
古川 良明*
「生体内銅イオン動態に着目した筋萎縮性側索硬化症の病理解明」
生化学 2018 Vol.90 pp.311-319
Original Paper 41
Tanaka G, Yamanaka T, Furukawa Y, Kajimura N, Mitsuoka K and Nukina N*
“Biochemical and morphological classification of disease-associated alpha-synuclein mutants”
Biochemical and Biophysical Research Communications 2018 Vol.508 pp.729-734
Original Paper 40
Fujiwara N*, Wagatsuma M, Oba N, Yoshihara D, Tokuda E, Sakiyama H, Eguchi H, Ichihashi M, Furukawa Y, Inoue T and Suzuki K
“Cu/Zn-Superoxide Dismutase Forms Fibrillar Hydrogels in a pH-Dependent Manner via a Water-rich Extended Intermediate State”
PLOS ONE 2018 Vol.13 e0205090
Original Paper 39
Furukawa Y*, Lim C, Tosha T, Yoshida K, Hagai T, Akiyama S, Watanabe S, Nakagome K and Shiro Y
“Identification of a novel zinc-binding protein, C1orf123, as an interactor with a heavy metal-associated domain”
PLOS ONE 2018 Vol.13 e0204355
We found C1orf123 protein as a new interactor with a copper chaperone protein CCS. This protein has a novel folding pattern, but we still have no idea on what this protein works for in our body. We are very much thankful to Dr. Tosha@RIKEN for X-ray crystallographic analysis of this brand new protein. Actually, we were almost scooped by the other research group: I was very surprised to see that almost the same paper was published several days after our paper came out!!
私たちの研究室での主要なターゲットであるCCS（銅シャペロンタンパク質）と相互作用するタンパク質を探索したところ見つかってきたものです。生体内での役割はよくわかっていないタンパク質で、立体構造（フォールド）としても新規なものです。私の研究人生で、酵母ツーハイブリッド法・X線結晶構造解析を行った初めての研究成果です。理研の当舎さんには随分とお世話になりました。実は、ほとんど同じ論文が数日後に発表されるという驚きもありましたが、発表日・結晶構造の登録日を見ても、私たちの勝利です！それにしても、タンパク質が生体内で担っている役割を明らかにすることは非常に難しいことだと痛感しました。
Original Paper 38
Okuzumi A, Kurosawa M, Hatano T, Takanashi M, Nojiri S, Fukuhara T, Yamanaka T, Miyazaki H, Yoshinaga S, Furukawa Y, Shimogori T, Hattori N and Nukina N*
“Rapid dissemination of alpha-synuclein seeds through neural circuits in an in-vivo prion-like seeding experiment”
Acta Neuropathologica Communications 2018 Vol.6 96
Original Paper 37
Tamaki Y, Shodai A, Morimura T, Hikiami R, Minamiyama S, Ayaki T, Tooyama I, Furukawa Y, Takahashi R and Urushitani M*
“Elimination of TDP-43 inclusions linked to amyotrophic lateral sclerosis by a misfolding-specific intrabody with dual proteolytic signals”
Scientific Reports 2018 Vol.8 6030
プレスリリース
共同研究の中でも、滋賀医科大学の漆谷先生に名前を載せていただいた本論文は、非常にインパクトのある研究でした。TDP-43というALSに関連したタンパク質に対する抗体を使って、治療法開発の可能性を示した論文ですが、プレスリリース発表や全国紙に取り上げられるなどの効果によって、患者さんやそのご家族から問い合わせをいただくようになりました。医療現場からは離れた立場で研究を行う私にとっては、身の引き締まる思いで、研究成果を社会発信することの重要性について、あらためて勉強させていただきました。
Among our five collaborative papers, the paper by Prof. Urushitani @Shiga-medical Univ. is quite impactful. This paper shows the therapeutic potential of the antibody against TDP-43, which seems to play pathogenic roles in ALS. Because of the press release, ALS patients and their family gave me the response to the study. I am a basic scientist and actually not involved in the medical care, so their response is quite important for me. Thanks to this collaborative study with Prof. Urushitani, I learned a lot about the importance of offering information on our research to the society.
Original Paper 36
Tokuda E, Nomura T, Ohara S, Watanabe S, Yamanaka K, Morisaki Y, Misawa H and Furukawa Y*
“A copper-deficient form of mutant Cu/Zn-superoxide dismutase as an early pathological species in amyotrophic lateral sclerosis”
Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease 2018 Vol.1864 pp.2119-2130
Our new paper has been published from BBA-Molecular basis of disease. Several groups including us have suggested that the metal binding in SOD1 is very important in maintaining the native structure and that the metal dissociation triggers misfolding of SOD1 in vitro. Our current study for the first time reveals the accumulation of copper-deficient SOD1 in very early stages of ALS. So, the copper-deficient form of SOD1 will be a promising target for developing a cure of the disease.
新しい論文がBBA-Molecular basis of diseaseから発表されました。私たちを含めていくつかの研究グループが、SOD1タンパク質への金属イオン結合が立体構造の形成・保持に重要であることを提案しており、少なくとも試験管内での実験では、金属イオンの解離によってSOD1はミスフォールド（構造異常化）することを報告しています。今回の私たちの研究では、銅イオンを解離したSOD1が、ALSのかなり初期に形成していることを初めて生体内で捉えることに成功しました。つまり、金属イオン解離型のSOD1はALS治療法開発のターゲットになりうることを示唆する研究と言えます。
解説記事3
Tokuda E and Furukawa Y*
“Abnormal protein oligomers for neurodegeneration”
Oncotarget 2017 Vol.8 pp.39943-39944
Original Paper 35
Fukuoka M, Tokuda E, Nakagome K, Wu Z, Nagano I and Furukawa Y*
“An essential role of N-terminal domain of copper chaperone in the enzymatic activation of Cu/Zn-superoxide dismutase”
Journal of Inorganic Biochemistry 2017 Vol.175 pp.208-216
Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) is an enzyme that disproportionates superoxide anion into hydrogen peroxide and molecular oxygen. The enzymatic activity of SOD1 requires the binding of copper and zinc ions and also the formation of a conserved intramolecular disulfide bond. In a eukaryotic cell, a copper chaperone for SOD1 (CCS) has been known to supply a copper ion and also introduce the disulfide bond into SOD1; however, a mechanism controlling the CCS-dependent activation of SOD1 remains obscure. Here, we characterized CCS isolated from a human liver fluke, Clonorchis sinensis, and found that an N-terminal domain of CCS was essential in supplying a copper ion in SOD1. Regardless of the presence and absence of the N-terminal domain, CCS was able to bind a cuprous ion at the CxC motif of its C-terminal domain with quite high affinity (Kd ~ 10−17). The copper-bound form of full-length CCS successfully activated C. sinensis SOD1, but that of CCS lacking the N-terminal domain did not. Nonetheless, the N-terminally truncated CCS with the bound copper ion was found to correctly introduce the disulfide bond into SOD1. Based upon these results, we propose that the N-terminal domain of CCS has roles in the release of the copper ion bound at the C-terminal domain of CCS to SOD1.
SOD1はスーパーオキサイドを過酸化水素と酸素分子に不均化する反応を触媒する酵素ですが、その活性中心には銅イオンを結合する必要があります。しかし、銅イオン単体は酸素分子と反応して活性酸素を生み出して、DNAや膜に酸化的な障害を加えるために、毒性の高い物質としても知られています。実際、細胞内に存在できる銅イオンの総量は厳密に制御されており、さらには、細胞内の銅イオンは何らかの生体分子と結合して、その毒性が抑えられた状態で存在しているとされています。つまり、SOD1のよう に、酵素活性の発現のために銅イオンを必要とするタンパク質にとっては、細胞内で銅イオンをうまく確保する必要があります。多くの真核生物で は、銅イオンを運ぶ「銅シャペロン」というタンパク質が、銅イオンを細胞内タンパク質に配給しています。SOD1の場合にはCCSと呼ばれる 銅シャペロンが作用します。CCSは３つのドメインからなるタンパク質ですが、N末端側のドメイン１がどのような役割を果たしているのかよく わかっていませんでした。そこで、ヒト、出芽酵母、そして、肝吸虫（C. sinensis）と呼ばれる寄生虫のCCSの反応性を比較することで、CCSのドメイン１は CCSに結合した銅イオンを 「離す」ために必要ではないかと提案しています。
Original Paper 34
Tokuda E, Anzai I, Nomura T, Toichi K, Watanabe M, Ohara S, Watanabe S, Yamanaka K, Morisaki Y, Misawa H and Furukawa Y*
“Immunochemical characterization on pathological oligomers of mutant Cu/Zn-superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosis”
Molecular Neurodegeneration 2017 Vol.12, Article No.2
A familial form of amyotrophic lateral sclerosis with SOD1 mutation (SOD1-ALS) is characterized by abnormal accumulation of misfolded SOD1 proteins in spinal motor neurons. We previously reported that mutant SOD1 in vitro formed the oligomers cross-linked via disulfide bonds (S-S oligomers); however, the pathological relevance of such oligomerization in the SOD1-ALS cases still remains obscure. To test if S-S oligomers form in the SOD1-ALS patients, we prepared the antibody specifically recognizing the S-S oligomers by immunizing rabbits with the S-S oligomers in vitro. Immunochemical examination of SOD1-ALS patients as well as ALS model mice was performed by using our antibody recognizing S-S oligomers. We found that the SOD1 oligomerization through the disulfide-crosslinking associates with exposure of the SOD1 structural interior and is a pathological process occurring in the SOD1-ALS cases.
SOD1遺伝子の変異が原因となって発症するALS（SOD1-ALS） では、SOD1タンパク質の分子内に形成するはずのジスルフィド結合が分子間に形成することで、SOD1の異常なオリゴマー化が進行すること を私たちは提案しています（JBC 2013 288 4970）。しかし、分子間ジスルフィド結合によってクロスリンクされたSOD1オリゴマー（S-Sオリゴマー）が、SOD1-ALS患者やALSモデルマウスにおいて本当に形成するのか、明らかではありませんでした。本研究では、S-Sオリゴマーを特異的に認識する抗体の作製に成功し、SOD1-ALS患者やALSモデルマウスの組織を免疫化学的な手法により検討したところ、病変部位である脊髄の前角領域にS-Sオリゴマーが形成していることを初めて見いだしました。S-Sオリゴマーを認識する抗体は、フォールド型SOD1の内部に埋もれた領域と相互作用することから、SOD1はS-Sオリゴマーを形成する際に大きくその構造を変化させることが分かりました。
Original Paper 33
Anzai I, Tokuda E, Mukaiyama A, Akiyama S, Endo F, Yamanaka K, Misawa H and Furukawa Y*
“A misfolded dimer of Cu/Zn-superoxide dismutase leading to pathological oligomerization in amyotrophic lateral sclerosis”
Protein Science 2017 Vol.26 pp.484-496
Pathogenic mutations have been proposed to monomerize SOD1 normally adopting a homodimeric configuration and then trigger abnormal oligomerization of SOD1 proteins. Here, we show that, around the body temperature (∼37 oC), mutant SOD1 maintains a dimeric configuration but lacks most of its secondary structures. Also, such an abnormal SOD1 dimer with significant structural disorder was prone to irreversibly forming the oligomers cross-linked via disulfide bonds. The disulfide-crosslinked oligomers of SOD1 were detected in the spinal cords of the diseased mice expressing mutant SOD1. We hence propose an alternative pathway of mutant SOD1 misfolding that is responsible for oligomerization in the pathologies of the disease.
私たちは、SOD1-ALSに見られる変異SOD1タンパク質のミスフォールディングについて研究を進めており、SOD1に変異が導入されると、本来は分子内に形成するはずのジスルフィド結合が分子間に形成し、SOD1の異常なオリゴマー化が進行することを明らかにしてきました（JBC 2013 288 4970）。しかし、疾患の原因となる変異が、なぜオリゴマー化につながるのか、その詳細なメカニズムが明らかでありませんでした。本研究では、円二色性分光（CD）、及び、X線小角散乱（SAXS）を主に駆使することで、オリゴマー化の前駆体となるSOD1の構造的特徴を明らかにしました。その結果、アミノ酸変異がSOD1構造を不安定化し、「二次構造を失った二量体」という特異な構造体を形成することで、オリゴマー化を促進することが分かりました。
Original Paper 32
Ishiguro T, Sato S, Ueyama M, Fujikake N, Sellier C, Kanegami A, Tokuda E, Zamiri B, Gall-Duncan T, Mirceta M, Furukawa Y, Yokota T, Wada K, Taylor JP, Pearson CE, Charlet-Berguerand N, Mizusawa H, Nagai Y*, and Ishikawa K*
“Regulatory Role of RNA Chaperone TDP-43 for RNA Misfolding and Repeat-Associated Translation in SCA31”
Neuron 2017 Vol.94 pp.108-124.e7
プレスリリース
A neurodegenerative disease, SCA31, is characterized by the RNA repeats of the UGGAA sequence. This study reports that TDP-43 binds the UGGAA repeats and functions as an “RNA chaperone” reducing the structural abnormalities of the bound RNA. Our group has contributed to this study by showing in vitro the binding of TDP-43 with the UGGAA repeat. TDP-43 was found to lose the binding ability of the UGGAA repeat by introducing the mutations at the amino acid residues responsible for the binding of single-stranded DNA/RNA.
（脊髄小脳失調症３１型（SCA31）ではUGGAA という５塩基のRNA繰り返し配列がみられます。本研究では、TDP-43がUGGAA繰り返し配列と結合し、RNAの構造異常を抑制する「RNA シャペロン」として機能することが報告されています。私たちのグループからは、精製したTDP-43タンパク質を用いて、UGGAAとの結合を生化学的な手法で確認したり、RNAとの結合に重要なアミノ酸残基に変異を導入することで、UGGAAと結合しなくなることを確認したりすることで、本研究に貢献することができました。）
Review Paper 6
Furukawa Y* and Tokuda E
“Aggregation of FET Proteins as a Pathological Change in Amyotrophic Lateral Sclerosis”
Advances in Experimental Medicine and Biology 2017 Vol.925 pp.1-12
Recently, FUS, which is a member of the FET protein family, was found to be linked to familial forms of amyotrophic lateral sclerosis, ALS. Soon later, mutations in the other proteins in this protein family, EWRS and TAF15, were also found to be causative of ALS. We have thus reviewed recent studies including ours on possible roles of high aggregation propensities of FET proteins in the ALS pathomechanism.
（家族性の筋萎縮性側索硬化症ALSの原因として、FETタンパク質ファミリーの一員であるFUSの遺伝子変異が近年に同定されました。その後、興味深いことに、同じタンパク質ファミリーに属するEWRSやTAF15の遺伝子変異もALS発症の原因となることが報告されました。そこで、FETタンパク質ファミリーに共通して見られる高い凝集性とALS発症メカニズムについて、私たちのこれまでの研究も含めて、近年の研究状況をまとめました。）