Tokuda E and Furukawa Y*
“Abnormal protein oligomers for neurodegeneration”
Oncotarget 2017 Vol.8 pp.39943-39944

Original Paper 35
Fukuoka M, Tokuda E, Nakagome K, Wu Z, Nagano I and Furukawa Y*
“An essential role of N-terminal domain of copper chaperone in the enzymatic activation of Cu/Zn-superoxide dismutase”
Journal of Inorganic Biochemistry 2017 Vol.175 pp.208-216

Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) is an enzyme that disproportionates superoxide anion into hydrogen peroxide and molecular oxygen. The enzymatic activity of SOD1 requires the binding of copper and zinc ions and also the formation of a conserved intramolecular disulfide bond. In a eukaryotic cell, a copper chaperone for SOD1 (CCS) has been known to supply a copper ion and also introduce the disulfide bond into SOD1; however, a mechanism controlling the CCS-dependent activation of SOD1 remains obscure. Here, we characterized CCS isolated from a human liver fluke, Clonorchis sinensis, and found that an N-terminal domain of CCS was essential in supplying a copper ion in SOD1. Regardless of the presence and absence of the N-terminal domain, CCS was able to bind a cuprous ion at the CxC motif of its C-terminal domain with quite high affinity (Kd ~ 10−17). The copper-bound form of full-length CCS successfully activated C. sinensis SOD1, but that of CCS lacking the N-terminal domain did not. Nonetheless, the N-terminally truncated CCS with the bound copper ion was found to correctly introduce the disulfide bond into SOD1. Based upon these results, we propose that the N-terminal domain of CCS has roles in the release of the copper ion bound at the C-terminal domain of CCS to SOD1.

SOD1はスーパーオキサイドを過酸化水素と酸素分子に不均化する反応を触媒する酵素ですが、その活性中心には銅イオンを結合する必要があります。しかし、銅イオン単体は酸素分子と反応して活性酸素を生み出して、DNAや膜に酸化的な障害を加えるために、毒性の高い物質としても知られています。実際、細胞内に存在できる銅イオンの総量は厳密に制御されており、さらには、細胞内の銅イオンは何らかの生体分子と結合して、その毒性が抑えられた状態で存在しているとされています。つまり、SOD1のよう に、酵素活性の発現のために銅イオンを必要とするタンパク質にとっては、細胞内で銅イオンをうまく確保する必要があります。多くの真核生物で は、銅イオンを運ぶ「銅シャペロン」というタンパク質が、銅イオンを細胞内タンパク質に配給しています。SOD1の場合にはCCSと呼ばれる 銅シャペロンが作用します。CCSは3つのドメインからなるタンパク質ですが、N末端側のドメイン1がどのような役割を果たしているのかよく わかっていませんでした。そこで、ヒト、出芽酵母、そして、肝吸虫(C. sinensis)と呼ばれる寄生虫のCCSの反応性を比較することで、CCSのドメイン1は CCSに結合した銅イオンを 「離す」ために必要ではないかと提案しています。

Original Paper 34
Tokuda E, Anzai I, Nomura T, Toichi K, Watanabe M, Ohara S, Watanabe S, Yamanaka K, Morisaki Y, Misawa H and Furukawa Y*
“Immunochemical characterization on pathological oligomers of mutant Cu/Zn-superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosis”
Molecular Neurodegeneration 2017 Vol.12, Article No.2

A familial form of amyotrophic lateral sclerosis with SOD1 mutation (SOD1-ALS) is characterized by abnormal accumulation of misfolded SOD1 proteins in spinal motor neurons. We previously reported that mutant SOD1 in vitro formed the oligomers cross-linked via disulfide bonds (S-S oligomers); however, the pathological relevance of such oligomerization in the SOD1-ALS cases still remains obscure. To test if S-S oligomers form in the SOD1-ALS patients, we prepared the antibody specifically recognizing the S-S oligomers by immunizing rabbits with the S-S oligomers in vitro. Immunochemical examination of SOD1-ALS patients as well as ALS model mice was performed by using our antibody recognizing S-S oligomers. We found that the SOD1 oligomerization through the disulfide-crosslinking associates with exposure of the SOD1 structural interior and is a pathological process occurring in the SOD1-ALS cases.

SOD1遺伝子の変異が原因となって発症するALS(SOD1-ALS) では、SOD1タンパク質の分子内に形成するはずのジスルフィド結合が分子間に形成することで、SOD1の異常なオリゴマー化が進行すること を私たちは提案しています(JBC 2013 288 4970)。しかし、分子間ジスルフィド結合によってクロスリンクされたSOD1オリゴマー(S-Sオリゴマー)が、SOD1-ALS患者やALSモデルマウスにおいて本当に形成するのか、明らかではありませんでした。本研究では、S-Sオリゴマーを特異的に認識する抗体の作製に成功し、SOD1-ALS患者やALSモデルマウスの組織を免疫化学的な手法により検討したところ、病変部位である脊髄の前角領域にS-Sオリゴマーが形成していることを初めて見いだしました。S-Sオリゴマーを認識する抗体は、フォールド型SOD1の内部に埋もれた領域と相互作用することから、SOD1はS-Sオリゴマーを形成する際に大きくその構造を変化させることが分かりました。

Original Paper 33
Anzai I, Tokuda E, Mukaiyama A, Akiyama S, Endo F, Yamanaka K, Misawa H and Furukawa Y*
“A misfolded dimer of Cu/Zn-superoxide dismutase leading to pathological oligomerization in amyotrophic lateral sclerosis”
Protein Science 2017 Vol.26 pp.484-496

Pathogenic mutations have been proposed to monomerize SOD1 normally adopting a homodimeric configuration and then trigger abnormal oligomerization of SOD1 proteins. Here, we show that, around the body temperature (∼37 oC), mutant SOD1 maintains a dimeric configuration but lacks most of its secondary structures. Also, such an abnormal SOD1 dimer with significant structural disorder was prone to irreversibly forming the oligomers cross-linked via disulfide bonds. The disulfide-crosslinked oligomers of SOD1 were detected in the spinal cords of the diseased mice expressing mutant SOD1. We hence propose an alternative pathway of mutant SOD1 misfolding that is responsible for oligomerization in the pathologies of the disease.

私たちは、SOD1-ALSに見られる変異SOD1タンパク質のミスフォールディングについて研究を進めており、SOD1に変異が導入されると、本来は分子内に形成するはずのジスルフィド結合が分子間に形成し、SOD1の異常なオリゴマー化が進行することを明らかにしてきました(JBC 2013 288 4970)。しかし、疾患の原因となる変異が、なぜオリゴマー化につながるのか、その詳細なメカニズムが明らかでありませんでした。本研究では、円二色性分光(CD)、及び、X線小角散乱(SAXS)を主に駆使することで、オリゴマー化の前駆体となるSOD1の構造的特徴を明らかにしました。その結果、アミノ酸変異がSOD1構造を不安定化し、「二次構造を失った二量体」という特異な構造体を形成することで、オリゴマー化を促進することが分かりました。

Original Paper 32
Ishiguro T, Sato S, Ueyama M, Fujikake N, Sellier C, Kanegami A, Tokuda E, Zamiri B, Gall-Duncan T, Mirceta M, Furukawa Y, Yokota T, Wada K, Taylor JP, Pearson CE, Charlet-Berguerand N, Mizusawa H, Nagai Y*, and Ishikawa K*
“Regulatory Role of RNA Chaperone TDP-43 for RNA Misfolding and Repeat-Associated Translation in SCA31”
Neuron 2017 Vol.94 pp.108-124.e7

A neurodegenerative disease, SCA31, is characterized by the RNA repeats of the UGGAA sequence.  This study reports that TDP-43 binds the UGGAA repeats and functions as an “RNA chaperone” reducing the structural abnormalities of the bound RNA. Our group has contributed to this study by showing in vitro the binding of TDP-43 with the UGGAA repeat. TDP-43 was found to lose the binding ability of the UGGAA repeat by introducing the mutations at the amino acid residues responsible for the binding of single-stranded DNA/RNA.

(脊髄小脳失調症31型(SCA31)ではUGGAA という5塩基のRNA繰り返し配列がみられます。本研究では、TDP-43がUGGAA繰り返し配列と結合し、RNAの構造異常を抑制する「RNA シャペロン」として機能することが報告されています。私たちのグループからは、精製したTDP-43タンパク質を用いて、UGGAAとの結合を生化学的な手法で確認したり、RNAとの結合に重要なアミノ酸残基に変異を導入することで、UGGAAと結合しなくなることを確認したりすることで、本研究に貢献することができました。) 

Review Paper 6
Furukawa Y* and Tokuda E
“Aggregation of FET Proteins as a Pathological Change in Amyotrophic Lateral Sclerosis”
Advances in Experimental Medicine and Biology 2017 Vol.925 pp.1-12 

Recently, FUS, which is a member of the FET protein family, was found to be linked to familial forms of amyotrophic lateral sclerosis, ALS. Soon later, mutations in the other proteins in this protein family, EWRS and TAF15, were also found to be causative of ALS. We have thus reviewed recent studies including ours on possible roles of high aggregation propensities of FET proteins in the ALS pathomechanism.